周伯勋,原籍陕西临潼,生于西安。中学时期参与创办红芽社剧团,演出一些鼓吹铲除军阀,打倒列强的短剧。1928年到上海,考入上海艺术大学文学系,不久加入南国社,1930年转入上海持志大学,并参加左翼作家联盟和左翼戏剧家联盟。1931年,在大道剧社参加《火的跳舞》《街头人》《SOS》《乱钟》等进步戏剧的演出,并参加了影片《玉堂春》的拍摄。其后,相继在联华影业公司拍摄的《续故都春梦》和电通影片公司拍摄的《桃李劫》《自由神》《都市风光》等影片中饰演主要角色。同时,他还担任电通影业公司的总务,剧务,发行,宣传等部门的负责工作。周伯勋剧照1936年,他返回西安,担任“西北各界救国会”宣传部副部长。1938年,进重庆中国电影制片厂任剧务科长,演员。抗日战争胜利后回到上海,在影片《一江春水向东流》中扮演庞浩公一角,获得好评,是他的代表作。后又在《武训传》中饰演张举人。
建国后,除参加拍摄了《球场风波》《红色的种子》等影片外,主要从事制片行政工作。在他一生近四十年的电影,舞台生涯中,共饰演了几十个经历不同,身份各异的反面人物。他力主反派正演,是中国影坛上以擅演反派角色的老演员之一。曾是中国电影工作者联谊会理事。